Corpo Discente - Egressos
Jamile Mariano Macedo Taborda
| Título | Avaliação in vitro e in silico da crotapotina de Crotalus durissus terrificus contra o alvo molecular Tripanotiona redutase de Leishmania spp. | ||||||||||||||||||||||||
| Data da Defesa | 19/12/2024 | ||||||||||||||||||||||||
| Download | Em sigilo | ||||||||||||||||||||||||
Banca
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| Palavras-Chaves | Crotapotina; Leishmaniose; L. braziliensis; Docking molecular; inflamassoma NLRP3; Crotalus durissus terrificus. | ||||||||||||||||||||||||
| Resumo | Buscando uma nova alternativa para o tratamento das leishmanioses, este trabalho propôs o isolamento e purificação da crotapotina da peçonha de Crotalus durissus terrificus, com o objetivo de avaliar seu potencial inibitório contra formas amastigotas axênicas de Leishmania amazonensis e a enzima Tripanotiona redutase recombinante (TRLb) de Leishmania braziliensis. Foram realizados ensaios in silico e in vitro para explorar essas interações. Primeiramente, nos experimentos de docagem molecular, as interações das moléculas de crotapotina ocorreram próximas ao sítio hidrofóbico e sítio Z, com energias calculadas de -7,635 kcal e -7,620 kcal, e valores de Kd estimados de 2,52 e 2,59, respectivamente. As interações entre as moléculas de crotapotina e TRLb nos sítios escolhidos mantiveram-se estáveis ao longo dos 100 ns de simulação de dinâmica molecular, conforme indicado pelos baixos valores de Root-Mean-Square Deviation (RMSD). Em seguida, foi obtida a crotapotina purificada com êxito. A expressão recombinante da TRLb foi realizada com sucesso, resultando em uma única fração após o lisado bacteriano, com massa relativa de 54 kDa e alta atividade enzimática em diversas concentrações. Nos ensaios de atividade enzimática, a TRLb apresentou-se ativa e em elevado grau de pureza. Nos ensaios de inibição, a crotapotina apresentou um percentual de inibição de crescimento dos parasitos de 41%. Nos ensaios contra amastigotas axênicas de Leishmania amazonensis, a crotapotina demonstrou uma atividade inibitória moderada. Na parte imunológica, foram realizados ensaios para avaliar a ação da crotapotina sobre PBMCs humanos. As células foram incubadas em diversas condições: sem inibidores (células em RPMI, células com LPS, células com nigericina, células com crotapotina a 25 µg/mL, e células com crotapotina a 50 µg/mL) e com inibidores (dissulfiram e apocinina). Foram analisados os tempos de 24, 48, 72, 96, e 120 horas para quantificação de LDH, produção de ROS e a ativação de citocinas. A crotapotina não induziu citotoxicidade significativa em PBMCs isolados. Em vez disso, mostrou um efeito modulador na resposta imune, evidenciado por uma produção controlada de IL-1β, uma redução mínima na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a preservação da viabilidade celular. A ativação do inflamassoma NLRP3 por crotapotina sugere seu potencial como imunomodulador terapêutico em doenças inflamatórias. Os resultados preliminares indicam que a crotapotina é um modelo promissor para o desenvolvimento de novos fármacos direcionados à inibição dos parasitos da leishmaniose. Novos ensaios são necessários para identificar a isoforma da crotapotina presente no estudo e outras demonstrações experimentais da estabilidade do complexo formado. | ||||||||||||||||||||||||
| Abstract | Seeking a new alternative for the treatment of leishmaniasis, this study proposed the isolation and purification of crotapotin from the venom of Crotalus durissus terrificus, aiming to evaluate its inhibitory potential against axenic amastigotes of Leishmania amazonensis and the recombinant enzyme Trypanothione reductase (TRLb) of Leishmania braziliensis. Both in silico and in vitro assays were conducted to explore these interactions. Firstly, in molecular docking experiments, the interactions of crotapotin molecules occurred near the hydrophobic site and site Z, with calculated energies of -7.635 kcal and -7.620 kcal, and estimated Kd values of 2.52 and 2.59, respectively. The interactions between crotapotin molecules and TRLb at the chosen sites remained stable throughout the 100 ns molecular dynamics simulation, as indicated by low Root-Mean-Square Deviation (RMSD) values. Next, crotapotin was successfully purified. The recombinant expression of TRLb was successfully performed, resulting in a single fraction after bacterial lysis, with a relative mass of 54 kDa and high enzymatic activity at various concentrations. In the enzymatic activity assays, TRLb was active and exhibited a high degree of purity. In inhibition assays, crotapotin showed a 41% inhibition rate of parasite growth. In assays against axenic amastigotes of Leishmania amazonensis, crotapotin demonstrated moderate inhibitory activity. In the immunological part, assays were conducted to evaluate the action of crotapotin on human PBMCs. The cells were incubated under various conditions: without inhibitors (cells in RPMI, cells with LPS, cells with nigericin, cells with crotapotin at 25 µg/mL, and cells with crotapotin at 50 µg/mL) and with inhibitors (disulfiram and apocynin). Time points of 24, 48, 72, 96, and 120 hours were analyzed for LDH quantification, ROS production, and cytokine activation. Crotapotin did not induce significant cytotoxicity in isolated PBMCs. Instead, it showed a modulatory effect on the immune response, evidenced by controlled IL-1β production, minimal reduction in reactive oxygen species (ROS) production, and preservation of cell viability. The activation of the NLRP3 inflammasome by crotapotin suggests its potential as a therapeutic immunomodulator in inflammatory diseases. Preliminary results indicate that crotapotin is a promising model for the development of new drugs targeting the inhibition of leishmaniasis parasites. Further assays are necessary to identify the isoform of crotapotin present in the study and other experimental demonstrations of the stability of the formed complex. | ||||||||||||||||||||||||
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