Corpo Discente - Egressos
Rafael de Souza Rodrigues
| Título | INVESTIGAÇÃO BIOLÓGICA E QUÍMICA DE ACTINOBACTÉRIAS DA AMAZÔNIA ISOLADAS NO CAMPUS DA UFAM DA RIZOSFERA DE Inga edulis | ||||||||||||||||||||||||
| Data da Defesa | 24/06/2024 | ||||||||||||||||||||||||
| Download | Em sigilo | ||||||||||||||||||||||||
Banca
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| Palavras-Chaves | Potencial biotecnológico, Inga edulis, Actinobactéria, Identificação molecular, Mineração genômica, Atividades biológicas, Pentamicina. | ||||||||||||||||||||||||
| Resumo | As actinobactérias são reconhecidas como prolíficas produtoras de produtos naturais de interesse biotecnológico. Esses microrganismos cosmopolitas são as principais fontes de antimicrobianos e, nas primeiras décadas do século XXI, surgiram como possíveis novas fontes de produtos naturais não antimicrobianos para interesses medicinais e agroindustriais. Prospecções nos mais diversos ecossistemas vêm apresentando novas espécies que se destacam em triagens com atividades, a saber: antimicrobiana, anticâncer, larvicida, antiparasitária, entre outras. Neste contexto, o desenvolvimento deste projeto de Tese de doutorado teve como objetivo geral: isolar actinobactérias da rizosfera de Inga edulis, uma leguminosa endêmica na região Amazônica e presente no campus da Universidade Federal do Amazonas; e avaliar seu potencial biotecnológico frente a um espectro de ensaios biológicos, tais como: antifúngico, anticâncer, antiparasitário e larvicida. Como também, realizar prospecção genômica de “Biosynthetic Gene Clusters” (BGCs) relacionados com à síntese de produtos naturais e identificar substâncias químicas relacionadas com as atividades biológicas. Esta Tese está dividida em três capítulos: No Capitulo 1 apresentamos uma revisão publicada no periódico “Antonie van Leeuwenhoek (Springer Nature)”. Nela descrevemos o potencial biotecnológico dos actinomicetos no século XXI, começando pelas atividades antimicrobianas e terminando com o potencial remediador de substâncias nocivas ao meio ambiente. No Capítulo 2 apresentamos um total de 64 isolados de actinobactérias da rizosfera de três pés de I. edulis e uma triagem, utilizando o método de culturas pareadas, com vinte linhagens selecionadas que são capazes de atenuar os crescimentos miceliais dos seguintes fitopatógenos: Colletotrichum sp. (ISO01), Colletotrichum guaranicola (P01), Pestalotiopsis sp. (3002R2), Conynespora cassiicola (Iso079) e Sclerotium coffeicola (M01). As análises moleculares do gene rRNA 16S das 20 linhagens as classificam em 2 dois gêneros: Streptomyces (80%) e Kitasatospora (20%). Dentre estas, foram selecionadas duas linhagens para produção de extratos e ensaios biológicos: Streptomyces sp. LabMicrA B270 não apresentou atenuação do crescimento micelial apenas para S. coffeicola (M01) e Streptomyces sp. LabMicrA B280 eficiente contra todos os fitopatógenos nos pareamentos de culturas. Os melhores resultados foram obtidos com a fração AcOEt/2-propanol 9:1 (fração que contém os metabolitos extracelulares). LabMicrA B270 apresentou atividade fungicida com a fracção AcOEt/2-propanol 9:1 com dosagem mínima de 250 µg/mL contra os quatro fitopatógenos que atenuou o crescimento micelial. LabMicrA B280 apresentou atividade fungicida com a fracção AcOEt/2-propanol 9:1 com dosagem mínima de 250 µg/mL para S. coffeicola e 125 µg/mL para os demais fitopatógenos. Estes resultados mostram que as 20 linhagens detêm potencial para serem usadas como agentes de biocontrole, bem como também fontes de substâncias com atividades fungicidas. No capítulo 3, apresentamos um estudo biológico e químico dos extratos produzidos pela linhagem LabMicrA B280. As análises morfológicas mostram que essa linhagem apresenta ornamentações miceliais semelhantes às espécies do gênero Streptomyces. Na análise filogenômica, seu valor de hibridização digital entre DNAs (dDDH) é < 70%, 63, 6 % o que a define como uma nova espécie do gênero Streptomyces. O genoma de LabMicrA B280 apresenta 8.2 Mb, distribuídos em 96 contigs, com conteúdo de G+C de 72%, N50 de 229434 e as ocorrências de 314 subsistemas, com 24 categorias de genes. As análises de mineração genômica resultaram em sete anotações de BGCs que apresentam 100 % de similaridade de um total de 39 BGCs. Dentre estes, destaca-se o BGC relacionado com a síntese da pentamincina, um antifúngico que também foi isolado da fração ME/AP/RF3 de LabMicrA B280. Os melhores resultados nos ensaios biológicos foram observados com a fração ME/AP/RF3: 125 µg/mL de dosagem mínima contra S. coffeicola (M01) e 62 µg/mL contra os demais fitopatógenos; 50 µg/mL de dosagem mínima para 91,45 % ± 0,55 de citotoxidade contra células cancerígena do epitelioma de laringe humano (HEp-2), sem efeito citotóxico contra as células saudáveis; atividades xi antiparasitárias com dosagens mínimas de 50 µg/mL contra as linhagens W2 e 3D7 de Plasmodium falciparum com efeito de mortalidades de 91,3 % ± 0,03 e 61,0 % ± 0,18; e 250 µg/mL de dosagem larvicida para alcançar 100% de mortalidade contra o Aedes egypti. Da fração ME/AP/RF3 de LabMicrA 280 foi isolada a substância pentamicina, potente fungicida usado no tratamento da candidíase vulvovaginal. O espectro biotecnológico da nova espécie LabMicrA B280 mostra que a Amazonia abriga actinobactérias com um grande potencial biotecnológico. Neste inédito trabalho que investigou as atividades biológicas de actinobactérias isoladas da rizosfera de I. edules, são apresentados resultados promissores para o desenvolvimento de métodos agrícolas mais sustentáveis, controle biológicos do Aedes egypti e metabólitos secundários com importantes atividades medicinais (anticâncer, citotóxica e antiparasitária). | ||||||||||||||||||||||||
| Abstract | Actinobacteria are recognized as prolific producers of natural products of biotechnological interest. These cosmopolitan microorganisms are the main sources of antimicrobials and, in the first decades of the 21st century, they emerged as possible new sources of non-antimicrobial natural products for medicinal and agro-industrial interests. Prospects in the most diverse ecosystems have presented new species that stand out in screening activities, namely: antimicrobial, anticancer, larvicide, antiparasitic, among others. In this context, the development of this doctoral thesis project had the general objective: to isolate actinobacteria from the rhizosphere of Inga edulis, a legume endemic to the Amazon region and present on the campus of the Federal University of Amazonas; and evaluate its biotechnological potential against a spectrum of biological tests, such as: antifungal, anticancer, antiparasitic and larvicide. As well as, carry out genomic prospecting for “Biosynthetic Gene Clusters” (BGCs) related to the synthesis of natural products and identify chemical substances related to biological activities. This Thesis is divided into three chapters: In Chapter 1 we present a review published in the journal “Antonie van Leeuwenhoek (Springer Nature)”. In it we describe the biotechnological potential of actinomycetes in the 21st century, starting with antimicrobial activities and ending with the remedial potential of substances harmful to the environment. In Chapter 2 we present a total of 64 isolates of actinobacteria from the rhizosphere of three feet of I. edulis and a screening, using the paired cultures method, with twenty selected strains that are capable of attenuating the mycelial growths of the following phytopathogens: Colletotrichum sp. (ISO01), Colletotrichum guaranicola (P01), Pestalotiopsis sp. (3002R2), Conynespora cassiicola (Iso079) and Sclerotium coffeicola (M01). Molecular analyzes of the 16S rRNA gene of the 20 strains classify them into two genera: Streptomyces (80%) and Kitasatospora (20%). Among these, two strains were selected for the production of extracts and biological assays: Streptomyces sp. LabMicrA B270 did not attenuate mycelial growth only for S. coffeicola (M01) and Streptomyces sp. LabMicrA B280 efficient against all phytopathogens in crop pairings. The best results were obtained with the AcOEt/2-propanol 9:1 fraction (fraction containing extracellular metabolites). LabMicrA B270 showed fungicidal activity with the EtOAc/2-propanol 9:1 fraction with a minimum dosage of 250 µg/mL against the four phytopathogens that attenuated mycelial growth. LabMicrA B280 showed fungicidal activity with the EtOAc/2-propanol 9:1 fraction with a minimum dosage of 250 µg/mL for S. coffeicola and 125 µg/mL for other phytopathogens. These results show that the 20 strains have the potential to be used as biocontrol agents, as well as sources of substances with fungicidal activities. In chapter 3, we present a biological and chemical study of the extracts produced by the LabMicrA B280 strain. Morphological analyzes show that this lineage presents mycelial ornamentation similar to species of the genus Streptomyces. In the phylogenomic analysis, its digital hybridization value between DNAs (dDDH) is < 70%, 63.6%, which defines it as a new species of the genus Streptomyces. The LabMicrA B280 genome has 8.2 Mb, distributed in 96 contigs, with a G+C content of 72%, N50 of 229434 and the occurrences of 314 subsystems, with 24 gene categories. The genomic mining analyzes resulted in seven BGC annotations that present 100% similarity out of a total of 39 BGCs. Among these, BGC related to the synthesis of pentamincine stands out, an antifungal that was also isolated from the ME/AP/RF3 fraction of LabMicrA B280. The best results in biological tests were observed with the ME/AP/RF3 fraction: 125 µg/mL minimum dosage against S. coffeicola (M01) and 62 µg/mL against other phytopathogens; 50 µg/mL minimum dosage for 91.45% ± 0.55 cytotoxicity against human laryngeal epithelioma cancer cells (HEp-2), without cytotoxic effect against healthy cells; antiparasitic activities with minimum dosages of 50 µg/mL against the W2 and 3D7 strains of Plasmodium falciparum with a mortality effect of 91.3% ± 0.03 and 61.0% ± 0.18; and 250 µg/mL larvicidal dosage to achieve 100% mortality against Aedes egypti. From the ME/AP/RF3 fraction of LabMicrA 280, the substance pentamycin, a potent fungicide used in xiii the treatment of vulvovaginal candidiasis, was isolated. The biotechnological spectrum of the new LabMicrA B280 species shows that the Amazon is home to actinobacteria with great biotechnological potential. In this unprecedented work that investigated the biological activities of actinobacteria isolated from the rhizosphere of I. edules, promising results are presented for the development of more sustainable agricultural methods, biological control of Aedes egypti and secondary metabolites with important medicinal activities (anticancer, cytotoxic and antiparasitic). | ||||||||||||||||||||||||
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