Corpo Discente - Egressos
Lorena Mota de Castro
| Título | ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE GENÔMICA DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAS) ISOLADAS EM RIOS DO AMAZONAS | ||||||||||||||||||||||||
| Data da Defesa | 29/04/2022 | ||||||||||||||||||||||||
| Download | Visualizar a Tese(3.54MB) | ||||||||||||||||||||||||
Banca
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| Palavras-Chaves | Polihidroxialcanoatos; Bactéria; Lignina; Genoma | ||||||||||||||||||||||||
| Resumo | Polihidroxialcanoatos (PHA) são polímeros que possuem potencial para substituírem os plásticos derivados de fontes não renováveis de substratos e são naturalmente acumulados por microrganismos. Este estudo propôs o isolamento, identificação e análise genômica de bactérias provenientes de águas escuras em tributários do Rio Amazonas, capazes de sintetizar PHA utilizando diferentes fontes de carbono como substrato. Um meio de cultivo seletivo foi elaborado a partir da água superficial coletada, que foi enriquecida com material orgânico > 100KDa ao ser filtrada em filtro tangencial. Uma alíquota da água coletada foi espalhada neste meio preparado e foram obtidos 28 isolados que, após replicação em meio mineral salino e confirmação da fluorescência, 6 isolados foram selecionados. Outras 3 bactérias foram incluídas neste estudo. O método de coloração das células com o corante BODIPYTM 505/515 também foi aplicado para confirmação das bactérias acumuladoras de PHA. Ralstonia pickettii LB_TupeA e Aquitalea sp. LB_TupeE foram isoladas de um lago de águas pretas localizado na reserva ecológica do Tupé, Iranduba, AM, Brasil. O isolado LB_TupeA foi capaz de acumular poli-(R)-3-hidroxibutirato [P(3HB)] quando cultivada em meio mineral salino acrescido de glicose, frutose e óleo de soja com rendimentos de 299.7, 573.4 e 622.2 mg.L-1 , respectivamente. Esta mesma cepa não acumulou PHA quando cultivada em lignina alcalina, porém P(3HB) foi detectado quando ácido vanílico e gálico foram utilizados em uma concentração de 10 g.L-1 . Por meio do sequenciamento e anotação genômica desta cepa, verificou-se que essa possui o arcabouço genético que possibilita o metabolismo desses derivados de lignina seguido da síntese de PHA. Altos rendimentos de P(3HB) foram obtidos com Aquitalea sp. quando submetida a cultura em uma fase, resultando em um aumento de 25x no acúmulo de PHA em comparação com a cultura em duas fases. Aquitalea sp. LB_TupeE produziu 1324.8 e 1060.0 mg.L-1 de P(3HB) respectivamente, quando foram utilizados como substrato glicose e sacarose. A identificação e confirmação taxonômica da cepa LB_RP2, isolada do rio Preto (Barcelos-AM), foi alcançada por meio de técnicas de análise genômica com a obtenção dos índices ANI (Average Nucleotide Identity) e TCS (Tetra Correlation Search) e análise de sequências multi-locus (MLSA) de genes do tipo housekeeping anotados do genoma deste isolado, confirmando assim que LB_RP2 se trata de um Bacillus paramycoides. Os genes associados as vias metabólicas de síntese de P(3HB-co-3HV) foram mapeados em B. paramycoides LB_RP2 e foi observado que esta cepa acumula P(3HB) quando cultivada em meios ricos em nutrientes. Em suma, esse é o primeiro relato de síntese de PHA por B. paramycoides e o sequenciamento de todo o genoma desses isolados permitiu a identificação do background genético para utilização de diversas fontes de carbono para a síntese de PHA. | ||||||||||||||||||||||||
| Abstract | Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polymers that have the potential to replace plastics derived from non-renewable sources of substrates and are also naturally accumulated by microorganisms. This study proposed the isolation, identification, and genomic analysis of bacteria from blackwaters in tributaries of the Amazon River, which are capable of synthesizing PHA using different carbon sources as substrate. A selective cultivation medium was prepared from the collected surface water, which was enriched with organic material of > 100 KDa when filtered in a tangential filter. An aliquot of the collected water was spread in this prepared medium and 28 isolates were obtained, which, after replication in saline mineral medium and fluorescence confirmation, 6 isolates were selected. Another 3 bacteria were included in this study. The method of staining the cells with the dye BODIPYTM 505/515 was also applied for confirmation of the PHA-accumulating bacteria. Ralstonia pickettii LB_TupeA and Aquitalea sp. LB_TupeE were isolated from a blackwater lake located in the Tupé ecological reserve, Iranduba, AM, Brazil. Bacillus paramycoides LB_RP2 was isolated from the Preto River, which is a tributary of the Negro River and located in Barcelos, AM, Brazil. R. pickettii was able to accumulate poly-(R)-3- hydroxybutyrate [P(3HB)] when cultivated in saline mineral medium with added glucose, fructose and soybean oil and produced yields of 299.7, 573.4 and 622.2 mg.L-1 , respectively. This same strain did not accumulate PHA when cultivated in alkaline lignin, but P(3HB) was detected when vanillic and gallic acid were used at a concentration of 10 g.L-1 . Through sequencing and genomic annotation of this strain, it was observed that it has a genetic framework that allows the metabolism of these lignin derivatives after the synthesis of PHA. High yields of P(3HB) were obtained with Aquitalea sp. when subjected to one-phase culture, which resulted in a 25-fold increase in PHA accumulation when compared to two-phase culture. Under the conditions mentioned, Aquitalea sp. produced 1,324.8 and 1,060.0 mg.L-1 of P(3HB) respectively, when glucose and sucrose were used as a substrate. The identification and taxonomic confirmation of LB_RP2 was achieved using genomic analysis techniques and acquisition of ANI (Average Nucleotide Identity) and TCS (Tetra Correlation Search) indices and analysis of multi-locus sequences (MLSA) of housekeeping-type genes annotated from the genome of this isolate, thus confirming that LB_RP2 is a Bacillus paramycoides strain. The genes associated with the metabolic pathways of synthesis of P(3HBco-3HV) were mapped in B. paramycoides LB_RP2 and it was observed that this strain accumulates P(3HB) when grown in nutrient-rich media. In short, this is the first report of synthesis of PHA by B. paramycoides, and the sequencing of the entire genome of these isolates permitted the identification of the genetic background for use of various carbon sources for PHA synthesis. | ||||||||||||||||||||||||
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