Corpo Discente - Egressos
Elenn Suzany Pereira Aranha
| Título | EFEITO ANTITUMORAL DE 22β-HIDROXITINGENONA OBTIDA DE Salacia impressifolia (MIERS) A.C. (CELASTRACEAE) CONTRA CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO | ||||||||||||||||||||||||
| Data da Defesa | 06/03/2020 | ||||||||||||||||||||||||
| Download | Em sigilo | ||||||||||||||||||||||||
Banca
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| Palavras-Chaves | Melanoma, Citotoxicidade, Invasão, Apoptose, Triterpeno quinonametídeo. | ||||||||||||||||||||||||
| Resumo | O melanoma é um tipo de câncer de pele com elevada capacidade metastática e significativa resistência tumoral aos tratamentos disponíveis. A busca por novas opções terapêuticas para o melanoma continua sendo um dos focos de investigações científicas em torno deste câncer, incluindo fontes oriundas de produtos naturais, como, por exemplo, a 22β-hidroxitingenona (22-HTG), um triterpeno quinonametídeo obtido da espécie Salacia impressiofolia. A presente tese teve como objetivo investigar o efeito da substância 22-HTG em células de melanoma. Inicialmente, foi avaliado o efeito de 22-HTG em propriedades relacionadas a progressão tumoral, como proliferação, migração e invasão celular, além de mecanismos de reprogramação do metabolismo energético, através da expressão gênica e atividade enzimática da lactato desidrogenase (LDHA). Posteriormente, foi investigado o mecanismo de morte celular induzido por 22-HTG por meio da análise das alterações morfológicas, ciclo celular, ensaio de morte celular pela marcação com anexina V-FITC/iodeto de propidio (Anexina/IP), potencial de membrana mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) utilizando citometria de fluxo e ainda coloração com laranja de acridina/ brometo de etídio (AO/BE) por microscopia de fluorescência. A expressão dos genes BRAF, NRAS e KRAS foi avaliada por RT-qPCR e também foram realizadas análises in silico por docking molecular. O potencial anti-invasivo de 22-HTG foi avaliado usando um modelo tridimensional (3D) de pele humana reconstruída com células de melanoma. Com os resultados obtidos foi possível identificar o efeito citotóxico de 22-HTG na linhagem de melanoma SKMEL28, com CI50 4,35; 3,72 e 3,29 µM após 24, 48 e 72 horas de exposição. Foi demonstrado que 22-HTG reduziu a viabilidade celular, inibiu da formação de novas colônias, reduziu a expressão gênica de LDHA, e ainda diminuiu a migração, invasão de células de melanoma e a atividade de metaloproteinases (MMP-2 e MMP-9). Quanto a investigação da morte celular, o tratamento com 22-HTG causou alterações morfológicas em células de melanoma, como redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear, características de apoptose. A continuação da investigação mostrou aumento de células marcadas com AO/BE e a apoptose foi confirmada com a marcação por Anexina/IP. A exposição a 22-HTG provocou redução do potencial de membrana mitocondrial, o que não estava relacionado ao aumento dos níveis de EROs. Usando o modelo 3D de pele humana reconstruída, 22-HTG reduziu a capacidade das células de melanoma invadirem a derme, relevando um potencial antimetastático. A expressão dos genes BRAF, NRAS e KRAS, alvos moleculares importantes no melanoma, foi reduzida pela presença de 22-HTG e o docking molecular demonstrou forte afinidade de ligação entre a substância testada e as proteínas BRAF e NRAS, o que pode ajudar a explicar os eventos celulares observados. A partir dos dados oriundos da tese, foi possível concluir que 22-HTG possui efeito anti-tumoral em células de melanoma, com a indução de apoptose e redução de eventos como proliferação, migração, invasão, a ação proteolítica de MMPs. Esse estudo fornece novas informações para trabalhos futuros acerca do uso de 22-HTG para o tratamento do melanoma. | ||||||||||||||||||||||||
| Abstract | Melanoma is a type of skin cancer with high metastatic ability and significant tumor resistance to conventional therapeutic. The search for new therapeutic options to melanoma remains one of the focus of scientific research around this type of cancer, including sources from natural products, such as 22β-hydroxytingenone, a quinonemethide triterpenes obtained from Salacia impressiofolia. The present thesis aimed to investigate the effect of the substance 22β-hydroxytingenone in melanoma cells. Initially, the effect of 22βhydroxytingenone on properties related to tumor progression, such as proliferation, migration, cellular invasion, and mechanisms of reprogramming of energetic metabolism, through the expression and enzymatic activity of lactate dehydrogenase (LDHA), was evaluated. Subsequently, the mechanism of cell death induced by 22-HTG was investigated through the analysis of morphological changes, following cell cycle, annexin V-FITC/propidium iodide assays (Annexin/PI), mitochondrial membrane potential, production of reactive oxygen species (ROS) by flow cytometry, and fluorescence microscopy with acridine orange/ ethidium bromide assay (AO/BE) staining. RT-qPCR was performed to evaluate the expression of BRAF, NRAS, and NRAS genes, and docking molecular was executed. The anti-invasiveness potential of 22-HTG was evaluated in a three-dimensional (3D) model of reconstructed human skin. With the results obtained, it was possible to identify the cytotoxic effect of 22-HTG in SKMEL28 melanoma cell line, with IC50 values of 4.35, 3.72, and 3.29 μM after 24, 48, and 72 h of incubation, respectively. It has been demonstrated that 22- HTG reduced cell viability, inhibited new colony formation, reduced LDHA gene expression, decreased migration and invasion of melanoma cells, and activity of metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9). Regarding the investigation of cell death, treatment with 22-HTG caused morphological changes, as cell shrinkage, chromatin condensation, and nuclear fragmentation. Further investigation showed an increase in AO/BElabelled cells and apoptosis was confirmed with Annexin/IP-labeling. Exposure to 22-HTG led to reduced mitochondrial membrane potential, which is not involved by increased oxidative stress. Using the 3D model of reconstructed human skin, 22-HTG reduced the ability of melanoma cells to invade the dermis, highlighting antimetastatic potential. Expression of BRAF, NRAS, and KRAS, important biomarkers in melanoma development, was reduced by 22-HTG treatment and showed a strong binding affinity with BRAF and NRAS proteins in molecular docking, which may help explain the observed cellular events. According to the data from the thesis, it was possible to conclude that 22-HTG has an antitumor effect on melanoma cells, with the induction of apoptosis and reduction of events such as proliferation, migration, invasion, proteolytic action of MMPs. This study provides new insights for future work on investigating the utilization of 22-HTG in malignant melanoma treatment | ||||||||||||||||||||||||
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